回答
(1)取孕期16～20周羊水15～30ml,1000r/ml离心10min,
(2)弃去多余上清液,留1ml羊水和沉淀细胞,轻轻打散成细胞悬液,
(3)移入25ml方形培养瓶中,加pH6.5～6.8(含青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml)的培养基3ml及小牛血清1ml,置37℃温箱中培养,
(4)培养7～10天后可见大量成纤维样或上皮样细胞集落,此时可调换新鲜培养液,
(5)待细胞集落扩大成片,并有许多透亮的圆形分裂细胞时,即可加入秋水仙素,使最终浓度为0.1～0.3μg/ml,置37℃温箱中再培养5～6h(上述过程均在无菌条件下进行),收获标准:①以成纤维细胞为主要类型,成片细胞生长;②以10倍目镜和20倍物镜观察,生长的细胞克隆覆盖1个或1个以上完整视野;③见到10个以上透亮的圆形细胞和10个以上双圆形光亮的分裂细胞,
(6)如果细胞生长不旺盛,生长周期不齐或细胞老化,未达收获标准,可在原瓶继续传代培养,方法:在无菌条件下先倒去培养液,加入2.5g/L无菌胰蛋白酶液数滴,摇动后倒去,再加入胰蛋白酶5～10滴,在37℃下轻轻摇动约5min,使贴壁细胞脱落,加入含小牛血清的新鲜培养基4ml,在37℃静置培养4～5h,再小心更换培养液,继续培养,一般传代后3～5天即可收获,
(7)将培养液移至刻度离心管中,加ED-TA-胰蛋白酶液1ml于培养瓶内,置37℃温箱中5min,然后用弯头吸管冲洗贴壁细胞(也可用2.5g/L胰蛋白酶溶液消化),将脱离瓶壁的细胞倒入离心管中,与原培养液相混合,并用少量温热生理盐水冲洗培养瓶,洗下的细胞也一并倒入该离心管,以1000r/min离心10min,
(8)吸弃上清液,加入预温37℃的0.075mol/L KCl低渗液3～5ml,置37℃10～15min,
(9)预固定、固定及制片均与外周血细胞染色体标本的制备法相同,
